摘要：PEDV引起的產房仔豬腹瀉是目前危害養豬業的主要三大傳染病（ASF、PRRS、PED）之一，給養豬業造成巨大的經濟損失。疫苗免疫仍然是防控PEDV的主要手段。為了提高疫苗的保護效果，本研究小組對PEDV疫苗在病毒含量、佐劑等方面進行了大幅改進，本文總結了改進后的疫苗免疫懷孕母豬，初生仔豬從母豬乳汁獲得被動保護的研究結果，表明該疫苗為產房仔豬PED的防控提供了更有效的措施。
關鍵詞：PED；PEDV；疫苗
自2011年底，由豬流行性腹瀉病毒（porcine diarrhea virus，PEDV）GⅡ群引起的豬流行性腹瀉（PED）在我國河南暴發以來，PEDV GⅡ快速蔓延至全國各大小豬場，目前已成為危害養豬業的三大傳染病（ASF、PRRS、PED）之一。該病主要危害新生仔豬，臨床表現為嘔吐、水樣腹瀉、脫水、消瘦、死亡，以7日齡內仔豬發病最為嚴重，發病率與死亡率可高達100%。生長育肥豬感染后偶有發病，死亡率低，但可能長期排毒，是豬場發病的病毒來源之一。對于PED的防控，疫苗免疫是比較經濟實惠的手段。豬流行性腹瀉病毒屬冠狀病毒科（coronaviridae）冠狀病毒屬（coronavirus），核酸為線性單股正鏈RNA，基因組約為28 kb，病毒粒子大小約為 90～195 nm。PEDV 基因組編碼的結構蛋白包括纖突蛋白（S）、小膜蛋白（E）、膜糖蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）。纖突蛋白（S）為主要的免疫原性蛋白，能誘導高水平的保護性抗體。為了給客戶提供更加安全高效的產品，本研究小組堅持持續對豬病毒性腹瀉滅活疫苗產品進行改進升級。目前通過提升抗原含量、保存抗原完整免疫原性及優化佐劑等，并評價其對仔豬的保護效力，結果表明其免疫效力顯著提升，表明大華農公司將為客戶提供更加優質的產品。1）疫苗：競品1與競品2是從市場購買的同類產品；止瀉威1、止瀉威2由廣東溫氏大華農生物科技有限公司提供。2）細胞及主要試劑：Vero細胞為本實驗室保存，DMEM培養基、胰蛋白酶和胎牛血清公司為Gibco產品。4）實驗動物：懷孕70日齡一胎母豬（二元雜），從新興某種豬場購得。5）攻毒毒株：MJ毒株，P5代，由廣東溫氏大華農生物科技有限公司提供。
2）攻毒方案：對止瀉威1、競品1、競品2免疫組及對照組所產5～7日齡哺乳仔豬進行攻毒，攻毒劑量為105.0 TCID50/頭，攻毒方式為口服。3）中和試驗：①生長良好的Vero細胞用胰蛋白酶消化，用DMEM生長液分散后，稀釋至5～8×105個/mL，最后將細胞加入96孔板中，0.1 mL/孔，96孔板置于37℃、5% CO2培養；②待96孔板中Vero細胞生長至致密，用DMEM培養液洗滌細胞3次，200 μL/孔/次，最后加入含適量胰蛋白酶DMEM培養液，100 μL/孔；③用DMEM2倍系列稀釋血清或乳汁至210，分別取100 μL與100 μL病毒液（1 000 TCID50/mL）混合，置于37 ℃、5%CO2孵育1 h，每個稀釋度重復4次；④去除步驟②中96孔板中培養液，每孔加入200 μL血清或乳汁稀釋液與病毒混合液，置于37 ℃、5% CO2孵育1 h后，棄除，用DMEM培養液洗滌細胞3次，200 μL/孔/次，最后加入含適量胰蛋白酶DMEM培養液，200 μL/孔，置于37 ℃、5% CO2培養5～7 d；⑤同時設病毒對照和陰性血清對照；⑥每日觀察細胞病變效應 （CPE）；⑦50%血清中和終點的計算：50% 細胞不產生細胞病變 （CPE） 的血清稀釋度。根據細胞病變程度，用 Reed-Muench 法計算 50%血清中和滴度。4）抗體檢測：IgG抗體與IgA抗體檢測按照試劑盒說明書進行。
1）血清中和抗體：該批母豬為一胎母豬，免疫前抗體小部分母豬為陽性（見圖1中免疫前中和抗體結果）。將母豬隨機分組進行2次免疫后，在二免后2周，從誘導血清中和抗體水平（見圖2）來看，止瀉威誘導中和抗體高于400，最高達512，且離散度低（小于10%），顯著優于同時對比的兩個競品。
2）初乳中SIgA抗體：采集產仔當天的乳汁（初乳），用IDEXX試劑盒檢測其中的SIgA抗體，從檢測結果（見圖2）可以看出，止瀉威誘導了高水平SIgA抗體，顯著高于兩個競品。3）初乳中和抗體：通過檢測初乳中和抗體（見圖3）發現，止瀉威免疫后誘導的中和抗體平均值達400以上，最高可達512，顯著高于兩個競品。
在仔豬哺乳5～7 d，采用野毒MJ株對其進行攻擊，每頭仔豬口服105 TCID50。在攻毒后24～48 h，對照組、競品1組、競品2組仔豬均出現不同程度嘔吐、腹瀉，止瀉威組在攻毒后3～5 d僅個別仔豬出現輕微腹瀉，各組仔豬腹瀉率、存活率及存活弱仔率見表2。綜合腹瀉發病率、存活率及存活弱仔率，止瀉威的保護效果顯著高于兩個競品。
目前市售的疫苗主要有豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯活疫苗及豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯滅活疫苗兩類疫苗，近幾年為PED的防控做出了巨大的貢獻。但是活疫苗免疫后能不同程度地排毒，排毒時間不一，增加豬場環境中的病毒載量，且活疫苗免疫后，豬只帶毒時間長，雖然在配懷舍，不排毒，但進入產房后可能迅速排毒，導致初生仔豬感染發病。采用傳統工藝制備的病毒性腹瀉滅活疫苗，抗原含量有限（108.0~9.0 TCID50/mL），且常用的滅活劑能一定程度地破壞抗原表位，導致免疫原性降低（數據未發表），因此，病毒性腹瀉滅活疫苗的免疫效力仍有提升的空間。本研究小組通過工藝改進有效提高了PEDV有效抗原含量，達200 μg/mL，且篩選到能完整保留病毒結構的滅活劑，以此制備的疫苗經本研究評估驗證，無論從二免疫后2周血清中和抗體、初乳中SIgA抗體及初乳中和抗體三項指標評價，還是從哺乳5～7 d初生仔豬的攻毒保護（仔豬腹瀉率、存活率及存活弱仔率）評價，豬病毒性腹瀉滅活疫苗免疫效力顯著優于競品疫苗，初生哺乳仔豬能獲得更優于競品疫苗的被動保護。作者：何玲,鐘采靈,王鳳國,梁桂益,孫華,陳瑞愛,黃紅亮/廣東溫氏大華農生物科技有限公司;麥凱杰/廣東精捷檢驗檢測有限公司
來源：《中國動物保健》2023年12月刊
