前 言
非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一種在豬之間的烈性傳染病。目前，該疾病已被列為必須向世界動物衛生組織（WOAH）報告的嚴重疾病。自非洲豬瘟爆發以來，給全球養豬業帶來了難以彌補的經濟損失，我國也不例外。為了防治非洲豬瘟帶來的嚴重經濟影響，控制和根除非洲豬瘟至關重要。疫苗接種是預防和控制非洲豬瘟擴散的最佳策略，但由于當前的非洲豬瘟病毒滅活疫苗的保護性差，并且沒有足夠高效的體外ASFV復制生產的細胞系，給豬瘟疫苗的有效推廣蒙上了陰影。因此仍然需要開發具有高免疫保護潛力且易于擴大化生產的非洲豬瘟疫苗。
非 洲 豬 瘟 病 毒
非洲豬瘟病毒具有二十面體對稱性，直徑為260 nm，呈同心圓結構，分為病毒核心，核心殼層，雙層內膜，衣殼，外囊膜等5層。
圖一：非洲豬瘟病毒顆粒結構圖
ASFV基因組長度在170-190kb，包含可變數量的開放閱讀框架(ORFs)，范圍從160到175個，可編碼150-200個病毒蛋白，包括68個結構蛋白和100多個非結構蛋白。
圖二：非洲豬瘟病毒顆粒編碼基因
ASFV形態發生在高爾基體和微管組織中心附近的核周病毒工廠，病毒組裝的第一個跡象是從內質網池中形成病毒膜前體，衣殼逐漸組裝后，這種病毒膜前體成為多面體中間體。隨著衣殼的形成，病毒核心在病毒的內膜下組裝，然后細胞內的成熟病毒工廠被轉移到細胞表面，并通過從質膜出芽離開宿主細胞相對于其他病毒來說，非洲豬瘟病毒更為復雜，體型也非常巨大，其生物學機制也相對復雜。
圖三：非洲豬瘟病毒顆粒感染過程與原理
2019年，中國科學院生物物理研究所饒子和/王祥喜團隊和哈爾濱獸醫研究所步志高團隊聯合上?？萍即髮W、清華大學、中國科學院微生物研究所、中國科學院武漢病毒研究所、南開大學等單位，合作在國際學術期刊 Science 上發表了題為 Architecture of African Swine Fever Virus and implications for viral assembly（非洲豬瘟病毒結構及裝配機制） 的學術論文，率先解決了這一世界級難題，為后續的科學研究和藥物疫苗提供了足夠的理論基礎。
圖四：非洲豬瘟病毒與其他病毒顆粒
ASF 疫 苗 開 發
ASF疫苗僅在國內就擁有超過10億頭的市場容量和百億級別的市場規模。在滅活疫苗、減毒疫苗、亞單位疫苗、載體疫苗以及核酸疫苗上近年來均有不同的進展。
Walczak等人通過分析從ASF存活動物身上收集的血清中和ASFV的可能性，指出抗ASFV抗體本身并不能抑制病毒復制。研究人員指出，這可能是由于ASFV特異性抗體并不能中和病毒：雖然滅活疫苗具有抗原性，但不能引起完全的細胞免疫反應，導致保護并不完全，將滅活的ASFV用作疫苗可能不切實際。Pikalo等人通過給斷奶仔豬接種疫苗，42天后再接種高致病力的“Armenia-2008”毒株，證明滅活疫苗免疫對高致病性的“Armenia-2008”ASFV 毒株沒有保護，雖然實驗表明接種滅活疫苗的動物體內含有特異性IgG，但沒有保護作用。上述試驗獲得了類似的結論，現有的數據證明使用現有方法開發有效的ASFV滅活疫苗存在挑戰。
2022年6-8月，越南與美國共同開發的減活疫苗在臨床生產使用時出現較多接種后生豬死亡，這個結果給減活疫苗的研發蒙上了陰影。但是，目前哈爾濱獸醫研究所在研的ASFV-7GD減活疫苗已在黑龍江、新疆和河南三個養殖基地開展臨床試驗，備受關注；普萊柯與中國農業科學院蘭州獸醫研究所合作的亞單位疫苗也已向農業農村部提交獸藥應急評價材料；華中農大與企業進行合作研發的基于病毒載體的ASFV疫苗也即將完成轉基因生物安全評價。
在mRNA疫苗開發方面，默沙東動物集團推出的Sequivity IAV-S NA打響了獸用疫苗的第一槍。目前，國內外已有企業陸續公布關于ASF相關mRNA疫苗研制的計劃或進展：美國Genvax公司與農業部合作開發saRNA疫苗；金宇保靈去年底與上藍鵲生物簽訂《ASF mRNA疫苗合作開發等等。
無論是從哪條途徑去開發非洲豬瘟相關病毒。深入研究ASFV基因組學和不同基因的功能（包括與免疫反應相關的基因）對于開發ASF疫苗都至關重要：P30、P54、P72、CD2v、EP153R等結構蛋白屬于ASFV最重要的一類保護性抗原蛋白，其中P54和P72均與病毒吸附有關；其中P30參與病毒入侵；CD2V參與紅細胞與感染細胞和細胞外病毒的結合，并與免疫逃逸相關；EP153R則可與MHC-I抗原呈遞調控有關；同時P72蛋白組裝需要B602L編碼分子伴侶的協助。
圖五：非洲豬瘟病毒顆粒相關重要基因
目前發現可用于制備降低ASFV毒力減活疫苗的相關獨立基因并不多，有I177L、9GL、CD2v、A137R、I226R、I267L、NL、UK 和DP148R 等，但是并沒有有效可行的商品化疫苗問世。因此發現和表征新的毒力決定基因對于合理開發下一代減毒活疫苗候選株至關重要。
由于易感動物在接觸ASFV后會迅速死亡，以往的調查無法確定病毒與宿主之間的聯系。大多數實驗證實，滅活疫苗會導致疫情進一步擴大，減毒活疫苗會導致免疫豬持續感染、排毒和副作用，而ASFV感染是否會產生中和抗體仍存在爭議。此外，不同毒株之間的交叉保護率很低，這使得篩選候選疫苗具有挑戰性。根據Qu及其同事的解釋，這可能有助于確定疫情中病毒的來源，并有助于ASF疫苗的開發。到目前為止，豬和生物安全三級（BSL-3）實驗室限制了疫苗的廣泛開發，因此很難獲得可靠的動物模型來評估疫苗的免疫效果。大量研究總結了用于確保疫苗接種安全性和評估在實驗中使用動物可行性的程序。不幸的是，最近中國農場出現的減毒株導致了慢性疾病、豬群臨床副作用和工業威脅。
除了使用多種 ASFV抗原或抗原片段以及優化佐劑和化學制劑的選擇外，還應關注現有毒株的保護性抗原及其理想的免疫機制。疫苗始終是預防和控制ASFV的基本策略和最佳工具。未來對ASFV病毒學和功能基因組學的研究將集中在蛋白質結構和功能、感染和免疫機制、作為免疫原的其他保護性抗原的鑒定、增強免疫保護的疫苗目標以及在目標動物中的全面測試等主題上。安全性和免疫效果也應在未來的研究中進行評估。
非洲豬瘟疫苗新方向——細胞免疫
由于大多數滅活疫苗提供的保護非常有限，對于非洲豬瘟的積極控制現在主要還依賴于改良性活病毒疫苗（MLVs）的開發。盡管保護的相關因素尚未完全理解，但改良活疫苗（MLVs）被廣泛人為可以很好的用于預防和治療。不過，它們確實也存在某些限制和風險，包括對異源PRRSV株的保護有限和潛在的回復毒力，特別是滅活疫苗效果不佳也會對異源的保護力弱；同時，中和抗體一般在感染后期才會出現，也給相關的防控效果帶了不利因素。
PRRSV一般會在體液和細胞兩個方面調節宿主的免疫反應，從而來調控免疫抑制以及繼發性感染與擴散，受到感染的動物會表現出延遲的中和抗體反應以及干擾素(IFN)分泌的中斷，從而有利于病毒的復制和傳播。PRRSV同時還降低了感染細胞中MHC-I的表達，有效抑制新生抗原的呈遞以及后續細胞免疫對于病毒感染的擴散。
在豬體內，MHC-I存在三個經典的I型豬白細胞抗原復合體(SLA-I) 基因（SLA I-1/2/3）編碼的分子，并能夠在所有的有核細胞上表達。這些細胞表面蛋白結合并呈遞抗原給CD8+ T細胞，以引起細胞毒性反應。此外，CD8+ T細胞記憶的產生保護宿主免受復發性感染。在未受感染的細胞中，MHC-I呈遞內源性肽，主要是胞質肽，以信號顯示它們未被感染。大多數CD8+ T細胞表位由免疫蛋白酶體產生，這是一種ATP依賴的蛋白酶復合體，它裂解泛素化的蛋白質。然而，還存在其他抗原加工途徑，包括自噬和由furin及信號肽肽酶的蛋白質裂解。經典的蛋白酶體衍生肽由與抗原加工相關的ATP依賴蛋白復合體稱為轉運體，即TAP1/2，結合并運輸到內質網(ER)中。在ER內，肽由肽裝載復合體(PLC)裝載到未成熟的MHC-I α鏈上。這個鏈形成一個肽結合槽，并能夠與大多數長度為9個氨基酸（8-12）的肽段結合。由于空間阻礙，更長的肽很少被結合。一旦MHC-I分子裝載完成，它就獲得了成熟構象，從PLC解離，并被運輸到細胞表面，向CD8+ T細胞呈遞抗原。這些T淋巴細胞識別呈遞抗原的細胞為感染細胞，并啟動細胞溶解過程，包括產生和分泌細胞毒性顆粒和細胞因子，如干擾素γ(IFNγ)和腫瘤壞死因子α(TNFα)。
圖六：MHC分型
因為抗體反應通常不足以清除病毒，CD8+ T細胞被認為可能是另一個重要的非洲豬瘟病毒保護相關因素。迄今為止，已有幾項研究調查了隨機生成或預測的PRRSV衍生肽的免疫潛力，然而，目前尚不清楚這些肽是否在體內合成并被真實的提呈到細胞表面并從而引起免疫反應。免疫蛋白酶體通常在疏水性和堿性氨基酸后切割蛋白質，因此，某些預測或隨機產生的肽是否在細胞內被合成并呈遞，還需要通過實驗來確定。
研 究 方 法
細胞免疫研究的核心問題是首先要識別由MHC-I（I類主要組織相容性復合體)結合的病毒肽段，并確認它們具有很好的刺激CD8+ T細胞的能力。
基于這樣的出發點，研究人員：
1、從PRRSV（株AUT15-33）感染的細胞（SLA-I Lr-Hp）中免疫沉淀MHC-I/肽復合物，以分離病毒表位，并使用液相色譜與串聯質譜（LC-MS/MS）進行分析。
圖七：MHC復合物提取富集
利用抗MHC-I抗體PT85A對非洲豬瘟來源樣本的裂解液進行MHC-I復合物，進行富集；富集產物使用SDS-PAGE分析富集情況，然后進行Western blot驗證。用親和素-HRP檢測生物素標記的細胞表面蛋白，確認成功分離了45 kDa的MHC-I α鏈和12 kDa的β2微球蛋白分子，并且沒有其他細胞蛋白的主要污染（見圖七）。對照IgG進行的免疫沉淀也顯示出細胞裂解液中沒有非特異性結合。
以未被感染的細胞作為對照，利用被PRRSV菌株AUT15-33感染的豬巨噬細胞（PAMs）進行免疫肽組分析，研究人員發現PRRSV感染會導致MHC-I的下調。通過免疫熒光確認了細胞的成功感染情況；收獲后，通過免疫沉淀分離了MHC-I/肽復合物。洗脫樣品通過LC-MS/MS分析，獲得的質譜數據與AUT15-33和Sus scrofa兩個蛋白質數據庫進行比對分析，結果顯示：對未感染的PAMs樣本進行數據庫研究，這些樣本與Sus scrofa蛋白質組匹配，共鑒定出2387個肽組，肽鏈長度在7到13個氨基酸之間，絕大多數（63.64%）是九肽（圖八-a）。
圖八：MHC復合物提取富集
這些發現與文獻一致，表明大多數MHC-I結合肽的序列長度為九個氨基酸。此外，已知表位錨定殘基傾向于是疏水性或堿性氨基酸。數據也證實了在9肽的錨定殘基（位置2和9）處疏水性氨基酸的保守性（圖八-b）。
圖九：免疫肽相關蛋白質在ORF1中位置
值得注意的是，把采集的免疫肽組質譜數據與AUT15-33蛋白質數據庫進行比對分析，研究人員檢測到了來源于ORF1的多個編碼病毒非結構蛋白（NSPs，表1，圖九）來源的免疫肽組結果：其中七個免疫肽段與四種病毒蛋白酶相匹配——NSP1α、NSP1β、NSP2和NSP4，一個肽段來自跨膜蛋白NSP5，另一個來自NSP8，四個肽段與NSP9相匹配，即病毒RNA依賴性RNA聚合酶。為了確認通過LC-MS/MS獲得的病毒肽序列的正確性，研究人員進一步對相關免疫肽段的免疫原性進行了驗證。
2、利用這些已識別的肽段刺激先前感染過PRRSV豬的外周血單核細胞（PBMCs），并通過細胞內細胞因子染色（ICS）測量PRRSV特異性CD8+ T細胞反應。
表二：細胞及豬分型信息
研究人員篩選出13個最可靠的的PRRSV ORF1衍生肽段和兩個Sus scrofa衍生肽段（C1:ELNDRFANY, C2:KLRDLEDSL）進行肽段的合成，并通過體外PBMCs的再刺激和隨后的ICS評估其免疫原性。ICS相對于傳統的ELISPOT檢測具有更低的背景和更高的靈敏度，并且能夠特別篩選CD8+ T細胞的免疫反應情況。研究人員從生物樣本庫中隨機選擇了23頭仔豬的PBMCs，對合成的15個免疫肽段進行免疫活性分析：結果顯示，與陰性對照相比，有兩個免疫肽顯示出較高的免疫活性。低分辨率單倍型（Lr-Hp）分析結果也顯示，本研究中使用的所有PBMCs與PAMs共享相同的等位基因（表2）。
圖十：免疫原性ICS實驗結果
為了保證結果的可靠性，研究人員又利用四批PBMCs對15個PRRSV肽段（P1-P13）、2個內源性豬肽段（C1和C2）以及混合肽庫的免疫潛力進行體外刺激試驗的重復評估，同時，增加了陰性對照（ACN/DMSO）以及陽性或激活對照（PMA/ionomycin）。分析結果顯示，由所有13種MHC-I結合PRRSV免疫肽肽段等量組成的肽庫，在所有批次中均誘導了CD8+ T細胞特異性IFNγ反應，且比陰性對照高出5.4至10.5倍（圖十）。在用肽庫重新刺激后，總CD8+ T細胞群體中有0.69%至1.49%比例的細胞產生抗原特異性IFNγ，而TNFα或IFNγ/TNFα共激活的CD8+細胞數沒有顯著增加。值得注意的是，肽1（P1）在所有批次中顯示出最強的IFNγ反應，占總CD8+ T細胞群體的0.36%至1.26%。從未感染細胞中分離的MHC-I結合豬細胞來源的免疫肽（C1和C2）并沒有誘導IFNγ的產生，證實了它們的內源性特性。
圖十一：免疫原性細胞分選結果
此外，我們使用了未激活T細胞的標簽-CD27進行染色。在分化為效應（記憶）表型的過程中，CD27表達會耗盡。在該研究中，用肽庫和單一肽段刺激顯示與陽性對照PMA/ionomycin相比，未激活或CD27+CD8+T細胞的頻率更高，PMA/ionomycin是一種強有力的刺激（圖十一）。在PMA/ionomycin刺激的細胞中，有31.7%至70.1%，在肽庫刺激的細胞中有43.4%至73.0%，在P1刺激的細胞中有60.7%至88.9%屬于這種未激活群體。與肽庫和陽性對照刺激相比，用P1重新刺激的PBMCs中CD27?CD8+細胞的數量最低，這代表了一個高度分化的T細胞表型。
結果顯示，混合免疫肽庫比單一肽段表現出更好的T細胞誘導能力。
結 論
